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肝硬化患者外周血TLR、CD14表達及其與內毒素血癥的關系
作者：楊少奇， 王莉， 黃睿， 楊芝紅， 楊 力
作者單位：(1.寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內科，銀川 750004; 2.寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中心實驗室，銀川 750004)
【摘要】
目的 探討肝硬化患者外周血單個核細胞(PBMC)表面CD14、TOLL樣受體(TLR2、TLR4)的表達情況及其與內毒素血癥的關系。
方法 分別采用顯色基質鱟試劑試管法和流式細胞術檢測50例肝硬化患者和30例健康志愿者外周血內毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達。
結果 肝硬化患者外周血內毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達高于正常對照組(P<0.05);肝硬化合并腹水患者外周血內毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達高于肝硬化無腹水患者(P<0.05);肝硬化患者外周血內毒素濃度與PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達呈正相關(P<0.05)。
結論 肝硬化患者外周血內毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達均高于正常人，內毒素及內毒素受體CD14、TLR2、TLR4協(xié)同作用介導機體炎癥反應，可能導致肝硬化患者病情進一步加重。
【關鍵詞】 肝硬化;內毒素血癥;Toll 樣受體
內毒素血癥是肝硬化患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥，甚至致死的重要原因之一，至今其預防和治療效果不甚理想。內毒素的致病機制主要是依賴內毒素相關受體介導的，Toll受體2(TLR2)、Toll受體4(TLR4) 、CDl4是現已發(fā)現的內毒素相關受體[1]。本研究通過檢測肝硬化患者外周血血漿內毒素濃度及單個核細胞表面CD14、TLR2、TLR4的表達，進一步明確TLR的表達與內毒素血癥的關系。
1 材料與方法
1.1 研究對象
寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2008年12月1日-2009年3月1日收住院的乙肝肝硬化患者50例，其中男37例，女13例，年齡25-75 歲，平均(50.62±14.16)歲。所有乙肝肝硬化患者病例均符合2000年西安會議《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準[12]。肝功能分級采用Child-Pugh分級法，其中Child-Pugh A級28例，B級16例，C級 6例。并將患者根據有無腹水分兩組，其中肝硬化合并腹水者27例，無腹水者23例。
同期隨機選擇30例健康人作為正常對照，其中男21例，女9例，年齡23～80 歲，平均(52.26±14.46)歲。
1.2 標本來源
80例研究對象清晨空腹采集外周血3mL。其中2mL外周血注入抗凝管中，流式細胞技術檢測備用;1mL外周血注入加有1mL血液抗凝劑的無熱原試管中，制成二倍稀釋液。離心取上清液待檢內毒素濃度。
1.3 檢測方法
采用顯色基質鱟試劑試管法檢測內毒素濃度(東方鱟鱟試劑由廈門市鱟試劑實驗廠有限公司生產);采用流式細胞術檢測PBMC表面TLR2、TLR4、CD14的表達(CD14抗體，TLR2、TLR4檢測試劑，檢測結果用平均熒光強度的幾何均數表示。
1.4 統(tǒng)計學方法
所有實驗數據均由自動分析后獲取，應用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件建立數據庫并分析。計量資料參數采用均數±標準差表示;兩樣本均數比較采用t檢驗;多個樣本均數比較采用方差分析;兩變量關聯性采用Pearson相關性分析。
2 結果
2.1 外周血內毒素濃度檢測結果
經統(tǒng)計學處理，肝硬化患者外周血內毒素濃度(0.043±0.023)EU·mL-1顯著高于正常對照組(0.027±0.018)EU·mL-1(P<0.05);肝硬化合并腹水患者內毒素濃度(0.055±0.033)EU·mL-1顯著高于肝硬化無腹水患者(0.030±0.020)EU·mL-1(P<0.05)。
2.2 BMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達
經過統(tǒng)計學處理，肝硬化患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達顯著高于正常對照組(P<0.05);肝硬化腹水患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達顯著高于肝硬化無腹水患者組(P<0.05);肝硬化無腹水患者組與正常對照組有升高趨勢但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1(如圖1-4，見封3)。表1 各組間PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達肝硬化組與對照組比較*P<0.05;腹水組與無腹水組比較#P<0.05。
2.3 外周血內毒素濃度與PBMC表面 CD14、TLR2、TLR4表達的相關性
通過Pearson相關性分析，肝硬化患者外周血內毒素濃度、PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達呈顯著正相關性。內毒素濃度與CD14、TLR2、TLR4的表達呈正相關(r分別為0.369、0.461、0.521，P<0.05);CD14與TLR2、TLR4呈正相關(r分別為0.481、0.498，P<0.05);TLR2與TLR4呈正相關(r=0.53，P=0.002)。
3 討論
肝硬化患者由于存在腸道細菌菌群紊亂、門體分流等因素容易導致內毒素血癥產生，內毒素(Lipopolysaccaride，LPS)激活kupffer細胞等產生 TNF-α、IL-6等炎性因子，從而加重肝臟及其他相關臟器的損害[2]。內毒素血癥與肝硬化患者的自發(fā)性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病等并發(fā)癥的產生有關。
本研究采用顯色基質鱟試劑(試管法)檢測肝硬化患者內毒素濃度，結果表明：與健康人比較，肝硬化患者內毒素水平升高，肝硬化合并腹水患者組內毒素濃度高于肝硬化無腹水患者組。說明肝硬化患者存在內毒素血癥，并且內毒素與肝硬化發(fā)病及病情進展相關。肝硬化患者腸道通透性增加，腸道菌群產生的內毒素通過血循環(huán)進入肝臟及外周血，內毒素與內毒素結合蛋白(LBP)結合，通過內毒素信號轉導，引起下游的炎癥因子分泌，炎癥因子可能會引起機體免疫系統(tǒng)的紊亂，導致肝纖維化的發(fā)生或肝硬化進一步加重。內毒素可通過肝星狀細胞分泌細胞因子產生炎癥反應，內毒素本身又可能直接加重肝臟組織的損傷。肝硬化腹水的形成與內毒素血癥逐漸加重有關，進一步說明內毒素與肝硬化發(fā)病及疾病進展相關。
TLR2、 TLR4、 CD14等是在宿主抗病原微生物的免疫應答中起重要作用的內毒素相關受體分子，是內毒素誘導炎癥反應的始動環(huán)節(jié)[3]。其中TLR2、TLR4 是內毒素信號向細胞內轉導的“門戶蛋白”。TLR2、TLR4 、CDl4大量表達于外周血單個核細胞表面。研究顯示TLR的表達與肝硬化患者內毒素血癥及炎性因子的產生相關[4-6]。
本實驗采用流式細胞術檢測PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表達，發(fā)現乙肝肝硬化患者的表達明顯高于正常人，并且腹水患者PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表達高于無腹水患者，內毒素濃度與CD14、TLR2、TLR4的表達成正相關。本研究提示CD14、TLR2、TLR4 在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用，其原因可能是肝硬化患者內毒素水平升高，大量的內毒素進入血液，與單個核細胞接觸，引起單個核細胞對內毒素的應激和敏感度增加，導致 TLR表達的升高，TLR識別內毒素，啟動炎癥信號的跨膜轉導，激活轉導途徑，誘導細胞產生大量的炎性細胞因子，這些細胞因子在肝纖維化和肝硬化的發(fā)病中起著重要作用[7]。
本研究中，肝硬化患者隨著PBMC 表面CD14的表達增加，TLR2 顯著增加。隨著CD14的表達增加，TLR4 也顯著增加，進一步提示CD14、TLR2、TLR4能夠介導多種重要病原體成分與細胞的反應，是引起機體炎癥反應的關鍵分子[8-9]。
綜上所述，內毒素及內毒素受體CD14、TLR2、TLR4協(xié)同作用介導機體炎癥的反應過程，可能參與肝纖維化或導致肝硬化進一步加重。本研究為肝硬化的臨床治療提供新的思路和策略，從減少內毒素的角度，或阻斷內毒素信號傳導途徑，減少促炎細胞因子的產生，將有可能改善或延緩疾病的進程。隨著 Toll 樣受體與肝硬化研究的進一步深入，針對 Toll 樣受體靶向調節(jié)的藥物將對肝硬化的臨床治療開辟新的方向[10]。
參考文獻（略）
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